pcr原理及步骤图解
基因扩增实验又称PCR实验，其特点是能将微量的DNA大幅增加，PCR是分子生物学研究和实验的常规方法,广泛应用于生物学各个领域，如：检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病，癌基因的检测和诊断，DNA指纹、个体识别、亲子鉴别及法医物证，动、植物检疫，动物及其衍生产品检测，动物饲料、化妆品、食品卫生检测，转基因作物与转基因微生物检测等。
临床基因扩增实验又称 PCR 实验,是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法, 测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快 捷、对样品要求低等优点,因此被临床医生广为认可,已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。但是这种实验需要有能保证绝对安全、配置合理的实验室和非常规范的操作为前提。近年来对临床基因扩增检验实验室的建设越来越得到重视, 因为它对检测结果的可靠性、 准确性和安全性起到至关重要的作用。
一、PCR设计依据
《医疗机构临床基因扩增管理法》
《生物安全实验室建筑技术规范》 GB50346-2004
《洁净厂房设计规范》GB50073—2001
《高效空气过滤器》GB13554—92
《实验室生物安全通用要求》GB19489—2004
《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》WS233—2002 中华人民共和国卫生部
二、PCR实验室平面布局
基因扩增实验室又称PCR实验室，实验室原则上分为四个单独的工作区域，前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。扩增前区与扩增后区应严格分开。实验材料、试剂、记录纸、笔、清洁材料等，只能从扩增前区流向扩增后区，即从试剂准备区→样品处理区→扩增区→扩增产物分析区，不得逆向流动。实验室的气流也应从扩增前区流向扩增后区，不得逆向流动。各工作区域应设置缓冲间，工作间与缓冲间之间宜安装连锁装置。不同功能的核酸检验工作区应是分隔独立的工作室，并有明显的标志，各区间不能直通。各区之间如果是紧密相连，需安装物品传递窗。每个工作区域的顶部应安装紫外灯，紫外灯的波长为254 nm，安装数量为每20 m2安装一支40W的紫外灯。
实验室较为理想的布局模式为有一个专用走廊，试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区很规范地排列在一起，前三个区各有一个缓冲间，可供换工作服和工作鞋使用，顶上可装一紫外灯。内实验区域设为正压或常压状态，缓冲间内设为负压状态（可上设一抽风装置），使这三个区的空气流向为由实验区域内向外，缓冲间内通向内实验室和走廊的门可安装一种连锁装置，当一个门打开时，另一门必须处于关闭状态，防止出现两个门同时打开的情况。产物分析区可不设缓冲间，但应设为负压状态（装一个排风扇即可），使空气流向由外向内，以防止扩增产物的随空气流出。每一区域都须有明确的标记，工作按试剂准备区、标本制备区、扩增区至产物分析区单一流向进行，各区的仪器设备包括工作服、鞋、实验记录本和笔等都必须专用。
如果无法作到以上模式，以下基本要求必须做到：
1、四个区域必须是相互独立的；
2、各区的仪器设备及各种物品必须是专用的；
3、各区完全独
各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。
（一）、试剂贮存和准备区立，缓冲间可有可无。如为一个区套一个区的模式，区间不能直通，应有缓冲间，供换工作服及鞋子用，并保证两个区域间始终处于完全的分隔状态；
4、产物分析区应安装排风扇或其它抽风装置，维持负压。
5、实验室空调通风系统设计及压力控制
该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、 试剂的分装和主反应混合液的制备。 试剂和用于标本制 作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需 的贮存试剂。对与气流压力的控制,本区并没有严格的要求。
（二）、标本制备区
该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸 (RNA、 DNA) 提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定 RNA 时 cDNA 的合成。
本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外,由 于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应避免在本区内不必要的走动。
（三）、扩增反应混合物配制和扩增区
该区域主要进行的操作为 DNA 或 cDNA 扩增。此外,已制备的 DNA 模板和合成的 cDNA(来自样本制备 区 ) 的加入和主反应混合液 (来自试剂贮存和制备区 ) 制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式 PCR 测定中,通常在第一轮扩增后必须打开反应管,因此巢式扩增有较高的污染危险性,第二次加样必须在本 区内进行。
本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污 染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。
（四）、扩增产物分析区
该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测,此区域可不设。
本区是最主要的扩增产物污染来源,因此对本区的压力梯度的要求为:相对于邻近区域为负压,以避 免扩增产物从本区扩散至其它区域。
三、污染的预防与控制
PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中,常见的有以下几种污染类型:扩增产物 的污染;天然基因组 DNA 的污染;试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染,实验就必须停止, 直到找到污染源为止,而且实验结果必须作废,需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污 染源不但耗时而且繁琐,浪费人力物力。因此要避免污染,首先应是预防,而不是排除。
工作区域的严格划分
(1)各个实验区域设置合理;
(2)各个实验区域要有明显的标记(如醒目的门牌或不同的地面颜色等),以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。
合理的系统设置
(1)合理的空调通风系统设置,尽量采用全送全排的空调系统;
(2)严格的气流压力控制,保证不同的实验区内不同的压力要求。
规范的操作
(1)临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训,经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作;
(2)在实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。此外,操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施;
(3)清洁工作及时、正确。实验工作结束后,必须立即对本区进行清洁。除常规的消毒液体对表面进行擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外,对一些实验设备还应进行高压消毒处理。
严格的管理
(1)严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室,有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门;
(2)在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服(如不同颜色),当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域;
(3)尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。
(4)扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源,废液不能在实验室中倾倒,必须经消毒液浸泡消 毒后在远离实验室的地方弃掉,用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理,如焚烧等;
(5)扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质,应特别注意实验人员的安全防护。
(6) 完备的实验室配套设施完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件, 应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器,如超净工作台、离心机、加样器等。
扩增基因实验室装修工程：实验室的墙体，包括顶棚，应结构牢固、气密性好；所有阴角宜采用圆弧形线条过渡；墙体内壁光洁、不吸附、耐腐蚀、易清洗消毒；地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。
一、主体结构
主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝,从而解决容易污染、 积尘、不易清扫等问题。结构牢固,线条简明,美观大方,密封性好。
二、标准的三区分隔和气压调节
将 PCR 过程分成试剂准备、 标本制备和 PCR 扩增检测三个独立的实验区。 整个区域有一个整体缓冲走 廊。每个独立实验区设置有缓冲区, 同时各区通过气压调节,使整个 PCR 实验过程中试剂和标本免受气 溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。
可打开缓冲区Ⅰ,缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上和各扇门上都安装 有风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。
三、消毒
在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。
在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。
四、机械连锁不锈钢传递窗
试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。
五、地面
地面建议使用 PVC 卷材地面或自流坪地面,整体性好。便于进行清扫,耐腐蚀。没有条件的也可采用 水磨石地面,或大块的瓷砖(至少 800mm×800mm)接缝需要小于 2mm 。
六、照明
灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。
在建设的过程中应注意:
(1)规范的安装流程和全面的服务流程。
(2)严格按照规范科学设计的安装流程。
(3)安装前需要确定以下安装条件,如:电源电压,电源进线位置,电话网络线进线位置,进水水 压, 最小安装空间, 地面平整度, 通风孔、 进水管和下水管的位置等, 理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。
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